3 способа окрашивания по методу Грама

2024 Автор: Jason Gerald | [email protected]. Последнее изменение: 2023-12-16 11:35

Окрашивание по Граму - это быстрый метод, который используется для определения наличия бактерий в образце ткани и для классификации бактерий как грамположительных или грамотрицательных на основе химических и физических свойств их клеточных стенок. Окраска по Граму почти всегда используется в качестве первого шага в диагностике бактериальной инфекции.

Этот метод окрашивания назван в честь датского ученого Ганса Христиана Грама (1853-1938), который разработал этот метод в 1882 году и опубликовал его в 1884 году как методику различения двух типов бактерий со схожими клиническими симптомами: Streptococcus pneumoniae (также известного как Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) и бактерии Klebsiella pneumoniae.

Шаг

Метод 1 из 3: Подготовка предметного стекла микроскопа

Шаг 1. Подготовка к работе в лаборатории

Надевайте перчатки и длинную резину для волос, чтобы предотвратить бактериальное заражение исследуемого образца. Очистите рабочее место под вытяжным шкафом или в другом хорошо вентилируемом помещении. Перед началом работы проверьте горелку Бунзена и убедитесь, что микроскоп работает правильно.

Шаг 2. Стерилизовать предметное стекло микроскопа

Если предметное стекло грязное, промойте его мыльной водой, чтобы удалить масло и грязь. Очистите предметные стекла этанолом, средством для чистки стекол или другим методом, используемым в вашей лаборатории.

Шаг 3. Поместите образец на предметное стекло

Вы можете использовать технику окрашивания по Граму, чтобы идентифицировать бактерии в медицинском образце или культуру бактерий, растущих в чашке Петри. Для достижения наилучших результатов используйте окраску по Граму для тонких мазков образца. Рекомендуется использовать образцы возрастом менее 24 часов, поскольку более старые бактерии могут повредить свои клеточные стенки и не реагировать на окрашивание по Граму.

Если вы используете образец ткани, добавьте 1-2 капли на предметное стекло. Равномерно распределите по предметному стеклу, чтобы образовался тонкий слой разбрызгивания образца, сдвигая его за край другого стерильного предметного стекла. Дайте ему высохнуть, прежде чем делать следующий шаг.
Если вы берете бактерии из чашки Петри, простерилизуйте инокуляционную петлю в горелке Бунзена, пока она не загорится, а затем дайте ей остыть. С помощью петли капните стерильную воду на предметное стекло, затем простерилизуйте и снова охладите, прежде чем использовать его для сбора небольшого образца бактерий. После этого аккуратно перемешайте.
Бактерии, приготовленные в бульоне, необходимо снова перемешать с помощью мешалки, затем взять с помощью инокуляционной петли, как указано выше, без добавления воды.
Если у вас есть образец тампона (обычно это делается с помощью небольшой ручки с ватным наконечником), прикоснитесь к нему и осторожно поверните тампон над предметным стеклом.

Шаг 4. Слегка высокая температура может сделать хороший мазок

Тепло будет удерживать бактерии на поверхности предметного стекла, поэтому они не будут легко растворяться в процессе окрашивания. Быстро постучите по слайду два-три раза над горелкой Бунзена или нагрейте слайд над электрическим нагревателем. Не перегревайте, образец может быть поврежден. Если вы используете горелку Бунзена, это должно быть маленькое, но голубое пламя вместо большого оранжевого пламени.

В качестве альтернативы мазок также можно сделать с метанолом, добавив 1-2 капли метанола в сухой мазок, высушив оставшийся метанол на предметном стекле, оставив его на открытом воздухе. Этот метод минимизирует повреждение клеток и обеспечивает чистый фон изображения слайдов

Шаг 5. Поместите слайд над лотком для раскрашивания

Подносы для окрашивания изготавливаются из металлических, стеклянных или неглубоких пластиковых пластин с мягкой сеткой сверху. Поместите слайды поверх этих сеток, чтобы жидкость, которую вы используете, можно было слить в лоток.

Если у вас нет лотка для раскрашивания, вы можете поместить слайд на пластиковый лоток, чтобы распечатать кубики льда

Метод 2 из 3: процесс окрашивания по Граму

Шаг 1. Залейте мазок жидкостью кристаллического фиолетового цвета

С помощью пипетки опрыскайте образец бактерий несколькими каплями красителя кристаллического фиолетового, также известного как генцианвиолет. Оставьте на 30-60 секунд. Кристаллический фиолетовый (KV) в водном растворе разделяется на ионы KV + и хлорид (Cl-). Эти ионы проникают через клеточные стенки и клеточные мембраны как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Ион KV + взаимодействует с отрицательно заряженными компонентами бактериальных клеток, придавая клеткам пурпурный цвет.

Многие лаборатории используют кристаллический фиолетовый «Хакер», который содержит оксалат аммония для предотвращения осаждения

Шаг 2. Осторожно промойте Crystal violet

Наклоните предметное стекло и с помощью бутыли для промывки обрызгайте его небольшой струей дистиллированной или водопроводной воды. Вода должна стекать по поверхности мазка, и ее нельзя распылять непосредственно на мазок. Не смывайте чрезмерно. Он может удалить окрашивание грамположительных бактерий.

Шаг 3. Промойте мазок йодом, затем ополосните

Промойте мазок йодом пипеткой. Оставьте на 60 секунд, затем тщательно промойте, как описано выше. Йод в форме отрицательно заряженного иона взаимодействует с KV + с образованием большого сложного комплекса между кристаллическим фиолетовым и йодом (комплексный комплекс CV-I) во внутреннем и внешнем слоях клетки. Этот комплекс соединений сохранит фиолетовый цвет кристаллического фиолетового внутри клетки на окрашенных участках.

Йод - едкое вещество. Избегайте вдыхания, проглатывания и контакта с кожей

Шаг 4. Добавьте отбеливатель и быстро смойте

Для этого важного этапа обычно используется смесь ацетона и этанола в соотношении 1: 1, который необходимо тщательно рассчитать. Установите предметное стекло под определенным углом, затем добавьте цветной отбеливатель до тех пор, пока фиолетовый не перестанет быть видимым в воде, используемой для полоскания. Обычно это занимает менее 10 секунд или даже меньше времени, если отбеливатель содержит высокую концентрацию ацетона. Немедленно остановите этот шаг, иначе краситель также выщелачивает кристаллический фиолетовый из грамположительных и отрицательных клеток, и процесс окрашивания необходимо повторить. Немедленно смойте излишки отбеливателя, используя предыдущую технику.

Вместо него можно использовать чистый ацетон (95% +). Чем больше ацетона вы используете, тем быстрее подействует отбеливатель, поэтому вам нужно уделять больше внимания времени.
Если у вас возникли проблемы с отслеживанием времени на этом этапе, по каплям добавляйте цветной отбеливатель.

Шаг 5. Нанесите контр-краситель на мазок, затем смойте

Контркрашивание, обычно сафранин или фуксин, используется для увеличения контраста между грамотрицательными и грамположительными бактериями путем окрашивания обесцвеченных (обесцвеченных) бактерий, то есть грамотрицательных бактерий, в розовый или красный цвет. Оставьте не менее 45 секунд, затем смойте.

Фуксин будет интенсивно окрашивать многие грамотрицательные бактерии, такие как Haemophilus spp и Legionella spp. Этот способ хорош для новичков

Шаг 6. Высушите предметное стекло

Вы можете высушить их на открытом воздухе, чтобы высушить, или высушите их, используя бумагу для выпечки, продаваемую для этой цели. Процесс окрашивания по Граму завершен.

Метод 3 из 3: Проверка результатов раскраски

Шаг 1. Подготовьте световой микроскоп

Поместите предметное стекло под микроскоп. Бактерии сильно различаются по размеру, поэтому общее требуемое увеличение будет варьироваться от 400 до 1000 раз. Для получения более четкого изображения рекомендуется использовать объектив с иммерсионным маслом. Капните иммерсионное масло на предметное стекло, избегая движения при капании, чтобы предотвратить образование пузырьков. Переместите ручку линзы микроскопа так, чтобы линза объектива встала на место и коснулась масла.

Масляную иммерсию можно использовать только для линз специальной конструкции, но не для «сухих» линз

Шаг 2. Попробуйте определить грамположительные и грамотрицательные бактерии

Изучите предметное стекло под световым микроскопом. Грамположительные бактерии имеют пурпурный цвет, потому что кристаллический фиолетовый заключен в толстой клеточной стенке. Грамотрицательные бактерии будут иметь розовый или красный цвет, потому что кристаллический фиолетовый вымывается через тонкие стенки клеток, куда проникает розовый контр-краситель.

Если образец слишком толстый, результат может быть ложноположительным. Окрашивайте новый образец, если он показывает все грамположительные бактерии, чтобы убедиться в правильности результата.
Если вы используете слишком много отбеливателя, результат может быть ложноотрицательным. Окрашивайте новый образец, если он показывает все грамотрицательные бактерии, чтобы убедиться в правильности результата.

Шаг 3. Сравните полученные результаты с эталонным изображением

Если вы не знаете, как выглядят бактерии, изучите коллекцию эталонных изображений, обычно отсортированных по форме и окраске по Граму. Вы также можете просмотреть онлайн-базы данных на [Национальная база данных по микробным патогенам, Бактерии в фотографиях и на многих других онлайн-сайтах. Для облегчения идентификации ниже приведены примеры бактерий, которые обычно встречаются или важны для диагностики, классифицированные в соответствии с их статусом по Граму и формой.

Шаг 4. Определите грамположительные бактерии по их форме

Бактерии далее классифицируются в зависимости от их формы под микроскопом, чаще всего на кокки (сферические) или палочки (цилиндрические). Вот несколько примеров грамположительных бактерий (фиолетового цвета) в зависимости от их формы:

Грамположительные кокки обычно стафилококки (что означает групповые кокки) или стрептококки (что означает цепные кокки).
«Грамположительные палочки, такие как Bacillus, Clostridium, Corynebacterium и Listeria. Палочковые бактерии Actinomyces spp. обычно имеют ветви или нити.

Шаг 5. Определите грамотрицательные бактерии

Грамотрицательные бактерии (розового цвета) часто делятся на три группы. Кокки имеют шаровидную форму, стержни длинные и тонкие, а стержни кокковидной формы находятся между ними.

Грамотрицательные кокки Чаще всего встречается Neisseria spp.
Грамотрицательные палочки например, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas и многие другие. Vibrio cholerae можно увидеть как обычный стебель или изогнутый стебель.
Грамотрицательные «коккоидные» (или «коккобациллярные») палочковые бактерии. например, Bordetella, Brucella, Haemophilus и Pasteurella

Шаг 6. Внимательно проверьте, смешаны ли результаты

Некоторые бактерии трудно точно окрасить из-за хрупкости или восковой природы их клеточных стенок. Эти бактерии могут иметь смесь пурпурного или розового цвета в одной и той же клетке или между разными клетками в одном мазке. Эта проблема может быть выявлена в образцах бактерий старше 24 часов, но есть также некоторые виды бактерий, которые трудно поддаются окраске в любом возрасте, в котором производится выборка. Эти бактерии требуют более специализированных тестов для идентификации, таких как кислотостойкое окрашивание, наблюдение в бактериальной культуре, культуральных средах TSI или генетическое тестирование.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium и Propionibacterium spp. все являются грамположительными бактериями, но часто не имеют четкой окраски.
Маленькие тонкие бактерии, такие как Treponema, Chlamydia и Rickettsia spp. трудно поддается окрашиванию по методу Грама.

Шаг 7. Утилизируйте все оставшиеся расходные материалы и оборудование

Эта процедура утилизации отходов варьируется в зависимости от лаборатории и зависит от используемых материалов. Обычно жидкость в лотке для окрашивания сбрасывается в бутылки, помеченные как опасные отходы. Замочите предметные стекла в 10% растворе отбеливателя, затем выбросьте в контейнер для острых предметов.

подсказки

Помните, что результаты окрашивания по Граму будут хорошими только в том случае, если образец хороший. Важно проинформировать пациентов, чтобы они могли предоставить хороший образец (например, разницу между слюной и глубоким кашлем для получения образца мокроты).
В качестве отбеливателя этанол реагирует медленнее, чем ацетон.
Соблюдайте стандартные лабораторные правила для обеспечения безопасности.
Для практики используйте мазок со щеки, потому что он содержит как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. Если вы видите только один тип бактерий, возможно, вы используете слишком мало или слишком много отбеливателя.
Вы можете использовать деревянные застежки для фиксации слайда.

Предупреждение

Ацетон и этанол - легковоспламеняющиеся вещества. Ацетон удалит жир с ваших рук, облегчая усвоение кожей других химикатов. Надевайте перчатки и используйте их осторожно.
Не позволяйте мазку высохнуть, пока не смоете пятно по Граму или контрастное пятно.